在石灰质碱性土壤条件下，大樱桃常因铁的有效性降低而出现叶片缺铁黄现象，严重影响其光合作用、生长发育及果实品质，利用铁载体分泌菌调节根际微环境，提高铁的生物有效性，是一种更具可持续性的生物防治策略。本研究旨在从大樱桃根际土壤中筛选高效铁载体功能菌株，并通过盆栽接种试验评估其对模式植物番茄生长、光合特性及铁吸收的影响，以期为开发微生物菌肥防治大樱桃缺铁黄化提供理论依据。结果表明：
(1)研究采用铬天青CAS平板法，共计对164株大樱桃根际微生物产铁载体功能进行定量检测，84株菌株发生显色反应，铁载体相对分泌量为78.27%-63.57%，筛选出5株目的菌株，分别为Q191(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)、Q192（科赫氏泡状芽孢杆菌Cytobacilluskochii）、B152（液化沙雷氏菌Serratialiquefaciens）、X191(派博氏金黄杆菌Chryseobacterium piperi)和A122（皱纹假单胞菌Pseudomonascorrugata）；
(2)促生特性：明显出现颜色反应的菌株为Q191、Q191、B152、X191以及A122，IAA产量为3.41-20.94 mg/L，菌株A122、Q192、X191、Q191具有溶有机磷能力，菌株A122具有较强固氮能力，所有菌株溶无机磷与解钾能力均在1.50-2.50之间；
(3)促生效应：所有供试菌株均能促进番茄植株根系发育和地上部生物量积累，其中Q191、Q192、B152和A122菌株对根长和叶片鲜重的促进作用最为显著；接种Q191、B152、X191和A122菌株显著提高番茄植株叶片铁含量；接种菌株处理的番茄植株最大光化学效率显著提高，表明铁载体菌株通过缓解缺铁胁迫，增强了植株的光合能力。
综上，Q191、B152和A122菌株表现出优异的促生和铁活化能力，可作为潜在的功能微生物菌剂，用于开发防治大樱桃缺铁黄化的微生物肥料。本研究为利用根际促生菌（PGPR）调控植物铁营养、提高石灰性土壤作物生产力提供了新的理论依据和技术支撑。
The Effect of InoculatingSiderophore-producing Bacteria in Alkaline Soil Improveson the Growth PromotingEffect of Tomato Seedlings
Undercalcareous alkaline soil conditions, sweet cherry trees often suffer from irondeficiency-induced leaf chlorosis due to reduced iron availability, severelyimpairing photosynthesis, growth, and fruit quality. Utilizingsiderophore-producing bacteria to regulate the rhizosphere microenvironment andenhance iron bioavailability represents a more sustainable biocontrol strategy.This study aimed to screen high-efficiency siderophore-producing strains fromsweet cherry rhizosphere soil and evaluate their effects on model plant tomatogrowth, photosynthetic characteristics, and iron uptake through pot inoculationexperiments, providing a theoretical basis for developing microbial fertilizersto combat iron deficiency chlorosis in sweet cherries.The results showed:
(1)Using the chrome azurol S (CAS) plate method, a total of 164 rhizospheremicrobial strains were quantitatively tested for siderophore production. Amongthem, 84 strains showed colorimetric reactions, with relative siderophoresecretion levels ranging from 63.57% to 78.27%. Five target strains wereselected: Q191 (Bacillus subtilis), Q192 (Cytobacillus kochii), B152 (Serratialiquefaciens), X191 (Chryseobacterium piperi), and A122 (Pseudomonascorrugata).
(2)Plant growth-promoting (PGP) traits: Strains Q191, B152, X191, and A122exhibited significant color reactions, with IAA production ranging from 3.41 to20.94 mg/L. Strains A122, Q192, X191, and Q191 demonstrated organic phosphatesolubilization, while A122 exhibited strong nitrogen-fixing ability. Allstrains showed inorganic phosphate solubilization and potassium-releasingcapabilities within the range of 1.50–2.50.
(3)Growth-promoting effects: All tested strains enhanced tomato root developmentand aboveground biomass accumulation, with Q191, Q192, B152, and A122 showingthe most significant promotion of root length and leaf fresh weight.Inoculation with Q191, B152, X191, and A122 significantly increased leaf ironcontent in tomato plants. Additionally, the maximum photochemical efficiency(Fv/Fm) of inoculated plants improved markedly, indicating thatsiderophore-producing strains alleviated iron deficiency stress and enhancedphotosynthetic capacity.
Inconclusion, strains Q191, B152, and A122 exhibited excellent growth-promotingand iron-mobilizing abilities, making them potential candidates for microbialinoculants to develop biofertilizers for preventing iron deficiency chlorosisin sweet cherries. This study provides new theoretical and technical supportfor using plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) to regulate plant ironnutrition and improve crop productivity in calcareous soils.
引言
铁（Fe）是植物生长发育必需的微量元素，参与光合作用、呼吸作用、叶绿素合成及多种酶系统的活化过程。尽管铁在地壳中含量丰富，但在石灰质碱性土壤（pH ≥ 7.5）中，铁主要以难溶性的氧化物或氢氧化物形式存在，其生物有效性极低（Guerinot M L, 1994）。研究表明，土壤pH每升高1个单位，可溶性铁含量降低1000倍（Lucena J J, 2000），导致植物可利用的铁浓度远低于正常生长需求（10⁻⁹~10⁻⁴ mol/L），引发缺铁性黄化。这一现象在“策略Ⅰ”型植物（如大樱桃、番茄等）中尤为突出，严重影响其光合效率、生长势及果实品质（Römheld V, 1983）。
大樱桃（Prunus avium L.）作为高经济价值的蔷薇科果树，对缺铁胁迫极为敏感，在石灰性土壤栽培条件下普遍出现叶片黄化、树势衰弱及产量下降等问题。传统矫正措施（如施用螯合铁肥）虽有一定效果，但成本高且易受土壤pH限制，长期使用还可能引发环境风险（ZuoY, 2011）。因此，开发可持续的生物强化策略，如利用铁载体根际促生菌（Siderophore-producingPGPR）提高根际铁的有效性，成为当前研究热点。
铁载体促生菌通过分泌铁载体（Siderophore）螯合土壤中的难溶性铁，形成可被植物直接吸收的铁-载体复合物，这一过程不受土壤pH影响。近年研究发现，某些PGPR不仅能活化铁，还能合成植物生长激素（如IAA）、溶解磷钾等养分，协同促进植物生长。然而，不同植物根际微生物组存在宿主特异性，从目标作物根际筛选的功能菌株可能更具定殖和促生优势。
本研究以石灰性土壤栽培的大樱桃根际微生物为研究对象，通过铬天青（CAS）法筛选高效铁载体分泌菌株，评估其促生特性（如IAA合成、溶磷固氮能力），并利用番茄盆栽试验验证其对植物生长、铁吸收及光合性能的调控效应。研究结果将为开发针对大樱桃缺铁黄化的微生物菌剂提供理论依据，并为石灰性土壤作物铁营养管理提供绿色解决方案。
1 绪论
1.1 铁元素
1.1.1 铁元素介绍
铁（Fe）是植物生长的必需元素，作为细胞色素、铁氧还蛋白的组分，参与光系统I/II的电子传递链，催化过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性，缓解氧化胁迫。虽然它是地壳中第四大元素，在土壤中含量丰富，但多以难被植物利用的氧化物或氢氧化物形式存在，严重限制了植物对铁的高效吸收和利用。而在pH较高的碱性土壤中，铁的生物可利用度较低，游离铁的总浓度一般不高于10-15 mol/L，而植物正常发育所需铁的浓度为10-9-10-4mol/L，这导致植物缺铁现象普遍存在[42](Guerinot M L，1994)。而在世界范围内，碱性土壤面积约占农田面积的30%，占耕地面积的40%，这导致全球约有40%的耕地存在潜在性缺铁问题[42] (Guerinot M L，1994)，因此缺铁已成为继缺氮和缺磷之后农业生产所面临的第三大营养障碍因子[42,78] (Guerinot M L，1994、Vose P B，1982)。
1.1.2 植物缺铁机理
铁是植物生长必需的矿质元素，参与众多的生理代谢过程，例如呼吸、光合作用、激素合成等[12,54](刘伦衔，2018、Liang G，2022)。当铁缺乏时，植物由于叶绿素合成受到抑制，容易出现失绿现象，从而阻碍叶片的光合作用进程。而在严重缺铁时，植物生长发育矮小，产量及植物免疫性能降低[62](Ning X Y，2023)。不同植物对缺铁敏感性不同，据铁元素的吸收机制可以分为2种类型：“策略Ⅱ”型植物，是禾本科植物特有的以分泌铁载体来提升根际铁有效性的植物；“策略Ⅰ”型植物，是双子叶和非禾本科单子叶植物所共有的以高价铁还原和二价铁吸收为特征的植物[21,66](张林琳，2021、Römheld V，1983)，它通过活化根际的难溶性铁、诱导根系细胞的铁吸收系统、扩大根系的养分吸收面积几方面的协同作用改善根系对铁的吸收。铁载体（如儿茶酚型、羟肟酸型）对Fe³⁺具有超高亲和力（稳定常数可达1030以上），能竞争性夺取土壤矿物中的铁，甚至从植物病原菌的铁载体中“窃取”铁（称为“铁竞争”），抑制病原菌生长。研究显示，碱性条件下（pH≥7.5）时，传统植物“策略Ⅰ”（如双子叶植物依赖的H⁺分泌和Fe³⁺还原酶）效率低下，而铁载体螯合铁的能力不受pH影响，为植物提供了替代铁源。根系铁还原酶活性显著减低，严重抑制铁的吸收，实践显示，石灰性土壤上生长的葡萄、柑橘、苹果等“策略Ⅰ”型植物极易发生缺铁性黄化[50,75,76](Kassa A，2015、Tagliavini M，2001、Therby-Vale R，2022)，而玉米、小麦等“策略Ⅱ”型植物则不容易发生缺铁[12,21] (刘伦衔，2018、张林琳，2021)，这说明与“策略Ⅱ”型植物相比，“策略Ⅰ”型植物更易发生缺铁症状。大樱桃属于“策略Ⅰ”型植物，对缺铁敏感，尤其在碱性土壤栽培条件下，黄化严重，明显影响植株生长发育[15,20,26, 45,57,67](瞿慧萍，2014、叶优良，2001、Abay S，2017、Hrotkó K，2014、López-Ortega G，2016、Sanz M，1992)。
1.2 大樱桃
大樱桃（Prunus avium L.）为蔷薇科落叶果树，原产于欧洲和西亚，因为其果实的色泽、多汁、多糖等食品特征及抗菌、抗癌、降糖、消炎、保护心血管等健康特性深受消费者的喜爱[19,35,40](王亚军，2022、Carrión-Antolí A，2022、Faienza M F，2020)，现已在世界范围内广泛种植，世界粮农组织数据显示，在过去20年中，大樱桃栽培面积及产量逐年稳定增加[20](叶优良，2001)。19世纪末20世纪初引入中国[6,8](孔芬，2016、李宽莹，2020)，截至目前，中国大樱桃的种植面积已超过20万公顷，年产量达到了100万吨以上[17](魏朝鹏，2021)，主产区为山东、陕西、辽宁、河南、甘肃等省份，为干旱、半干旱集及碱性、盐碱土壤主要分布区[79](Zang Y，2023)。前期研究发现，碱性土壤（石灰质土壤）的高pH及碳酸盐导致土壤中铁的植物有效性降低，每升高1个pH 、可溶性铁含量降低1000倍[58,82](Lucena J J，2000、Zuo Y，2011)，作物则呈现缺铁黄化，俗称“诱导性缺铁黄化”[5,15, 65](金崇伟，2005、瞿慧萍，2014、Rabhi M，2007)，这在国内、外大樱桃栽培中也多有报道[45,67](Hrotkó K，2014、Sanz M，1992)。大樱桃对缺铁高度敏感，新叶叶脉间黄化（典型缺铁症状），严重时整叶白化、生长停滞，果实品质（糖酸比、色泽）显著下降。与苹果、梨相比，樱桃根系较浅，更易受表层土壤高pH影响。
1.3 铁载体根际促生菌
在自然条件下，植物通过根系从土壤中获得铁营养，土壤中铁的植物有效应含量受多因素的影响，如土壤pH、土壤微生物种类与活性、土壤有机质含量、土壤酶活性等[13,47,80](孟霞，2017、Jin C W，2014、Zhang X，2019)。铁载体根际促生菌是缺铁条件下，分泌铁载体(Siderophore)的一类根际促生菌(Plant growth promotingrhizobacteria，PGPR)，铁载体根际促生菌通过自身合成并且分泌铁载体，来增加宿主根际微生态环境中铁的生物有效性满足微生物自身[64](Piromyou P，2011)及植物[10,23,55](林彬，2014、张婷，2024、Liu D，2017)的生长需求。释放到土壤中的铁载体通过配合基的螯合反应，使难溶性的铁（如氧化铁和氢氧化铁）得以释放出来，并且形成Siderophore-Fe螯合物，从而增加了土壤中铁的生物有效性[5, 22,37](金崇伟，2005、张铭，2024、Crowley D E，1991)。铁载体能活化土壤中的难溶性铁，提高铁的溶解性和移动性，从而提高土壤中铁的有效性，既能达到校正植物缺铁失绿又达到保护生态和谐不失为一条可行性途径。近年来，许多研究者认为促生菌分泌的铁载体（Siderophore）与三价铁的螯合物是能直接被植物吸收，并推测这种机理是植物抗铁胁迫的第三策略（策略Ⅲ），近年来的一些实验都支持了这一假说[27,31](Abiraami T V，2021、Boukhalfa H，2002)。此外，铁载体的螯合过程不受pH影响，这对于石灰性土壤中“策略Ⅰ”型抗缺铁营养胁迫具有特殊的意义，并且不同植物根际微生态环境招募不同的微生物组群，因此来自同一宿主的PGPR或能更好地定殖于同一宿主根际[ 47,65](Jin C W，2014、Rabhi M，2007)。
1.4 研究目的、意义
鉴于以上论点，本研究以钙质土壤栽培的大樱桃根际筛选鉴定的铁载体促生菌为研究对象，采用番茄盆栽实验，探讨铁载体促生菌接种对番茄促生效应，旨在为缓解钙质和碱性土壤中大樱桃缺铁黄化病的营养管理提供理论基础。
2 材料及方法
2.1 供试菌株的获取与培养
2.1.1 土样采集
采用五点取样法于大樱桃基地内采集大樱桃根际土壤，取样深度约为15cm。将采集的土壤样品放入密封袋中，做好标记，置于冰盒中带回实验室，-80℃保存，用作大樱桃根际土壤高效铁载体细菌、促生菌的筛选。取土工具与封口袋均提前用高压灭菌锅121℃灭菌2h。
2.1.2 大樱桃根际菌株的分离与纯化
取大樱桃根际土壤10g，放入100mL无菌水中充分混合后制作成为1:10的悬浊液，静置一段时间，待土粒沉淀后取1mL上清液加入1000mL无菌水中制备成10-3稀释液，以同样方法依次制备10-4和10-5稀释液。在超净工作台上用移液枪取土壤稀释液100μL，通过涂布平板法，接种至配置好的LB固体培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、琼脂粉15 g、蒸馏水定容至1000mL，pH值7.0±0.2）中，均匀涂布，每个梯度重复3次。用封口膜密封，标签标记，放入生化培养箱中29℃培养24h，及时观察菌株生长状况和形态特征并标记不同菌株。
采用稀释涂布平板法在29℃生化培养箱中对分离出的菌株培养48h，及时观察、标记平板内出现的杂菌。及时统计并使用接种环对所有标记菌株进行平板划线，定时观察是否有单菌落。若未出现则重复划线至分离出单菌落后放入冰箱留存。
平板划线法为后续目的菌株参考《常见细菌系统鉴定手册》的宏观表征观察提供依据。
2.1.3 产铁载体菌的筛选鉴定
MSA限铁培养基的配制：用标准天平称取磷酸氢二钾1.0 g、七水合硫酸镁0.5g、蔗糖20.0 g、天冬酰胺2.0g、琼脂20.0g，加入去离子水，玻璃棒搅拌直至溶解，用去离子水定容至1000 mL后，再调pH至7.2左右。将培养基放入高压灭菌锅内121℃灭菌30 min。
CAS检测液:（1）1mM FeCl3储备液:1mmol FeCl３·6H２0 溶于1000mL蒸馏水；（2）CAS储备液:称取0.2421g铬天青(CAS)溶解于200mL蒸馏水中；（3）HDTMA溶液：称取 0.0219g HDTMA(十六烷基三甲基化)溶解于 50mL蒸馏水中，搅拌均匀；（4）PIPES储备液：取4.3079g无水派嗪溶于30mL蒸馏水中，用浓盐酸调节pH值至6.8；（5）取1.5mL 1mM FeCl3储备液、7.5mL CAS储备液、50mL HDTMA溶液、30mL PIPES储备液和11mL H2O混合，配置为100mLCAS染液。
细菌产铁载体功能定性检测：接种2%菌液（体积分数）于含MSA限铁液体培养基的96孔板中，28℃、150 r/min 振荡培养48 h，取CAS检测液与孔板中液体1：1充分混匀，静置2h后观察细菌显色情况（CK:双蒸水+CAS检测液）。
2.2 菌株促生特性测定
2.2.1 产铁载体含量测定
将-20℃甘油储藏菌株TSB培养基活化，在OD600为0.6-0.8时取2%量接种于MKB限铁培养基中，28℃，170 r/min振荡培养2d；8000 rpm离心10 min，取上清液与CAS检测液1：1充分混匀，静置反应2 h，用分光光度计测定波长630 nm吸光值（As），用双蒸水作为对照，以无菌的TSB液体培养基与 CAS 检测液各3 mL反应的吸光值为参比值（Ar），分别定量菌株发酵2 d的铁载体产量。根据下来公式计算铁载体活性单位（Su）：Su =[(Ar–As)/Ar]×100%[69](SchwynB，1987)。
2.2.2 产IAA含量测定
胰酪大豆胨液体培养基TSB：胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml， pH7.2。
L-色氨酸溶液（L-Trp）：胰蛋白胨15g,大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，L-色氨酸0.1g,蒸馏水1000ml，pH7.2。
Salkowski染液：0.5mol/L FeCl3与35％高氯酸1：50混合。
菌液培养，统一OD600≈0.6。菌液按2% 接种量接种于含200mg/L（L-Trp）的TSB溶液中，28℃、120r/min条件下摇床培养48h，8000r/min离心10min，取等量上清液与Salkowski检测液混匀避光反应30min后用分光光度计法测定OD530。
通过IAA不同质量浓度标准品溶液与Salkowski比色计进行显色反应，用紫外分光光度计测量样品溶液在波长530nm处的吸光度。根据IAA标准曲线计算发酵液中3IAA含量。
2.2.3 溶磷、固氮、解钾能力测定
有机磷选择性培养基：葡萄糖10.0g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，七水合硫酸亚铁0.03g，四水合硫酸锰0.03g，卵磷脂0.2g，碳酸钙5.0g，酵母膏0.4g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.00-7.50。
无机磷选择性培养基：葡萄糖10.0g，磷酸钙5g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.2g，氯化钾0.2g，七水合硫酸镁0.03g，硫酸铁0.003g，硫酸锰0.03g，酵母膏0.5g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.00-7.50。
解钾筛选培养基：蔗糖5.0g，磷酸氢二钠2.0g，七水合硫酸镁0.5g，无水三氯化铁0.005g，碳酸钙0.1g，钾长石粉1.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.00-7.50。
固氮培养基：酵母提取物0.50g，甘露醇20.0g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾0.8g，七水合硫酸镁0.2g，二水合硫酸钙1g，无水三氯化铁0.01g，二水合钼酸钠0.002g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.00-7.50。
2.3 菌液制备
将5株目的菌株A122、B152、Q191、Q192、X191接种至TSB液体培养基中，然后置于恒温水浴振荡器中，在36℃，170 rpm/min条件下振荡培养至对数生长期得到种子液。种子液按2%的接种量转接于新鲜的TSB液体培养基中，36℃，170 rpm/min振荡培养24h后菌液离心，3000 rpm/min，离心10min，弃上清液，添加无菌水，至1*107CFU/mL，备用，用于番茄盆栽试验。
2.4 番茄幼苗培育
2.4.1 土壤理化性质
用一次性牙刷仔细刷取植物根上附着的土壤，用无菌水充分洗涤 样本，用70％酒精浸泡一定时间后，接着用2.5% NaClO (溶液中含有0.1%吐温80）浸泡5min 后再用70%乙醇溶液浸泡30s，最后用无菌水洗涤样品3次，样品冻存于-80℃冰箱里作为待 测样品。对土壤用孔径为 2 mm 的土样筛过筛备用，并通过重铬酸钾容量法、Olsen 法、氢氟酸-高氯酸消解法、邻菲罗啉比色法、火焰光度法等检测方法对土壤样品进行土壤理化性质测定（表 1）。
2.4.2 番茄幼苗培育
栽培土壤未经灭菌，在每盆称取160g土壤。
番茄种子采用使用10%次氯酸钠溶液对种子消毒10分钟，再用无菌水冲洗多次，而后用无菌水浸泡6h，在26±1℃恒温条件下进行催芽。选取籽粒饱满、生长一致的露白种子播种，每盆（规格：15×13cm）播种3颗，每个处理5个重复，置于26℃/22℃、16/8h（光照/黑暗）交替、光照强度5500 Lux，相对湿度为45%的人工气候培养箱内培养。在培养10d后间苗，每盆留1株长势一致的番茄幼苗，期间定期补充无菌水。在培养30d后，处理每盆浇160 mL菌悬液（1g土壤接种1mL菌液），以无菌水作为对照，再继续培养45d后测定相关指标。
2.5 项目测定
2.5.1 形态指标测定
根长：采用直尺测量根茎至最长根尖的距离。
植株鲜重：采用电子天平分别测量地上部分鲜重与地下部分鲜重。
2.5.2 铁离子含量及光合特性测定
铁离子含量：选取番茄苗顶部第1与2片幼叶，将叶片消解后采用邻菲啰啉分光光度计法测定铁离子含量[25](周晓霞，2011)。
叶绿素含量：采用95%无水乙醇和80%丙酮1:1（V:V）混合液为浸提液，在黑暗避光抽提，直至叶片组织变白，以提取液为对照，分别测定波长663 nm、470 nm和 645 nm吸光度, 叶绿素总量按照Lichtenthaler方法计算[49](Ju S，2020)。
净光合速率（Pn）：选取第二片完全展开的叶片作为测试点，在晴天上午9:00-11:00利用便携式光合仪（GFS-3000, Heinz Walz Gmbh,Effeltrich, Germany）进行测定，环境温度19.020.7℃，相对湿度60-70%，环境CO2浓度453-512 ppm，光强1000 μmoL•m-2•s-1[25](周晓霞，2011)。
荧光动力学参数：采用植物效率分析仪测定（Handy PEA+, Hansatech,England），测定前叶片暗适应20 min，时间分辨率精确到纳秒，设定时3间为2秒钟，光源的强度为2000μmol• m-2 •.s-1，测定其荧光动力学相关参数[11](刘东娜，2023)。
2.6 数据分析
采用SPSS 26.0对数据进行单因素方差分析（ANOVA）以及最小显著性差异法（LSD）多重比较（P<0.05），采用Origin 2022软件绘制柱状图。
3 结果与分析
3.1 促生菌株筛选特性
3.1.1 产铁载体菌株初筛结果
研究以大樱桃作为材料，利用96孔板显色反应定性检测产铁载体能力较强的菌株，初步为解决植物根际土壤缺铁问题提供参考依据,共计对164株大樱桃根际微生物产铁载体功能进行定量检测。
与对照相比,共84株菌株发生显色反应，占比为51.22%。其中43株菌株发生轻微颜色变化，占比为26.22%；23株菌株为浅黄色，占比为14.02%；15株菌株颜色较深，占比为9.15%；3株颜色极深，占比为1.83%。15株颜色较深的菌株分别为B152、D1、E2、Q2、Q132、Q141、Q143、Q192、X11、X221、Y19、Y20、Y21、Y28、Y32；3株颜色极深的菌株分别为A122、Q191、X191。
3.1.2 产铁载体菌株复筛结果及宏观表征观察
对经过8000r/min离心10分钟的上清液重复1：1添加CAS染色液，避光静置2h，用双蒸水作为对照，以无菌的TSB液体培养基与 CAS 检测液各3 mL反应的吸光值为参比值，研究结果显示（图1）不同菌株铁载体分泌能力不同，Q191>Q192>B152>A122>X191，铁载体相对分泌量为78.27%~63.57%。明显出现颜色反应的菌株为Q191、Q191、B152、X191以及A122，故认为上述菌株产铁载体能力较好。
目的菌株于TSA固体培养基平板上划线分离单菌落，28℃培养48h，记录菌落宏观表征参考《常见细菌系统鉴定手册》（见表3）。结果表明，菌株Q191：单菌落形态呈圆形，颜色为淡黄色，菌落边缘不规则，表面较光滑，无渗出液，无明显气味；Q192：菌落均匀生长，边缘轻微不规则，颜色为乳白色，表面光滑，无明显特殊气味；B152：光滑、湿润、边缘整齐，易扩散生长，不透明，成熟后呈乳白色黏液状，无特殊气味；X191：菌落较小，圆形、凸起，边缘整齐，不扩散生长。典型金黄色或淡黄色光滑、稍粘稠，无明显特殊气味；A122：初期为光滑圆形，后期产生典型皱纹状隆起，颜色呈乳白色，菌落边缘不规则，产生荧光色素。
3.1.3 菌株生长量测定及菌株发酵对菌液PH调解的测定
菌株接种至LB培养基，36°C，培养48h见表4。
菌液按2%接种量接种至TSB液体培养基，36℃、170 r/min 条件下振荡培养24h，pH仪测定菌液pH。
3.1.4 16sRNA序列测定与系统发育分析
将筛选纯化后的菌株16S rDNA序列测序结果拼接后在NCBI-Blast程序中对比，找到与菌种序列同源性较高的菌种，与相应菌种的模式菌再次进行比对，确定序列相似度，用MEGA 7 软件构建 16S rDNA 系统发育进化树，确定进化关系。发现菌株Q191为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）与Bacillus subtilis strainBB035（GenBank登录号: PP087462.1）同源性为99.93%、菌株Q192为科赫氏泡状芽孢杆菌（Cytobacillus kochii）与Cytobacillus kochii strainFORCN151（GenBank登录号: MW363351.1）同源性为100.00%、菌株B152为液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）与Serratia liquefaciensstrain ZMT-1（GenBank登录号: KU999993.1）同源性为99.38%、菌株X191为派博氏金黄杆菌（Chryseobacterium piperi）与Chryseobacterium piperistrain ZJPC18 （GenBank登录号: OM319789.1）同源性为99.85%、菌株A122为皱纹假单胞菌（Pseudomonas corrugata）与Pseudomonas corrugatastrain KLC5（GenBank登录号: MT634421.1）同源性为100.00%。
3.1.5 促生菌株IAA分泌相对含量
IAA标准品质量浓度分别为10、20、30、40、50mg/L时，测得吸光度分别为0.241、0.633、0.990、1.339、1.676，用Excel处理并绘制得到标准曲线y=27.94x+2.74，R2=0.999(见图3)。
3.1.6 促生菌株溶磷、固氮、解钾情况
菌液培养，统一OD600≈0.6。
接到相应选择培养基上，28℃培养4~7 d，若有透明圈生成则说明具有相应活性。采取十字交叉法测定透明圈直径（D）和菌落直径（d），每个记录3个并计算D/d值.
菌株A122、Q192、X191、Q191具有溶有机磷能力，其中Q192溶有机磷能力较强，D/d在3.00-3.25之间；菌株A122具有较强固氮能力，D/d在2.75-3.00之间；所有菌株溶无机磷与解钾能力均在1.50-2.50之间（表5）。
3.2 盆栽试验效应
3.2.1 铁载体促生菌对番茄幼苗生物量的影响
数据显示（图6），铁载体促生菌接种均能促进番茄苗根系及地上部的生长，促生效应Q191 ˃B152 ˃A122˃X191˃Q192，与对照相比，Q191 ，B152 ，A122菌株对番茄地根长，RFW，SFW及TFW均达到显著水平，X191˃Q192显著提高SFW及TFW，而根长和RFW未达到显著效果。
3.2.2 铁载体促生菌对番茄幼苗叶绿素含量及光合效率的影响
数据显示（图7），与对照相比,接种Q191，B152，A122菌株显著提高番茄叶片的叶绿素含量及Pn， X191、Q192随提高番茄叶片的叶绿素含量及Pn，而未达到显著水平。作用效应 Q191˃B152˃A122 ˃X191˃Q192。
3.2.3 铁载体促生菌对番茄幼苗叶片铁元素的影响
数据显示（图8），铁载体促生菌接种均能提高番茄幼叶铁元素浓度，尤其Q191、B152、X191、A122 达到显著水平，但不同菌株效应不同，Q191 ˃A122˃B152˃X191˃Q192。
3.2.4 铁载体促生菌对番茄幼苗叶片荧光动力学曲线的影响
OJIP曲线显示，铁载体菌株接种均能降低O~J，J~I，I~P阶段的荧光值，但是不同菌株作用效应不同，降低效应依次为B152˃A122˃X191 ˃Q192˃Q191（图9A）。所选5种菌种处理的相对荧光你与对照处理差异显著，Q191、Q192、B152、X191、A122的J点相对荧光分别比对照处理低 13.48%、17.87%、12.06%、21.00%和16.14%（P＜0.05）（图9B）。接种铁载体菌株均能不同程度降低Fo，Fm, 而增加Fv，但未达到显著效果（图9C）。
3.2.5 铁载体促生菌对番茄幼苗叶片荧光参数的影响
研究显示（图10），与对照相比，接种不同的铁载体菌株显著提高了Fv/Fm 和 PIabs， 显著降低了Mo，均达到显著水平，不同程度降低了Wk，并且B152,X191和A122处理达到显著水平（图10A）。对PSⅡ能量分配比率影响研究显示，与对照相比，接种菌株不同程度显著提高 ψo ，φPo， φEo，φRo，(图10A,B)。光能利用效率相关指标分析显示，与对照相比，接种不同的铁载体菌株不同程度降低 ABS/CSm，但是均为达到显著水平。 不同程度提高了TRo/ CSm，但是均未达到显著水平。 显著增加ETo/ CSm，而显著降低了DIo/ CSm，均达到显著水平（图10C）对光系统Ⅱ（PSⅡ）反应中心活性参数分析显示，与对照相比，接种不同的铁载体菌株不同程度降低了 ABS/RC, 均达到显著水平。同时导致 TRo/RC的不同程度降低，B152,X191和A122处理达到显著水平。相反 ETo/RC显著提高， 而DIo/RC显著降低，个处理均达到显著水平（图10D）。
4 讨论与结论
4.1 讨论
碱性（钙质）土壤接种铁载体菌株，能促进植物生长，缓解作物的缺铁黄化[41,68](Ferreira C M H，2019、Sarwar S，2020)。本研究选用的5株铁载体促生菌筛选自大樱桃根际，分别是Q191：枯草芽孢杆菌Q191（Bacillus subtilis Q191）、Q192：科赫氏泡状芽孢 杆菌Q192（Cytobacillus kochii Q192）、B152：液化沙雷氏菌B152（Serratia liquefaciens B152）、X191：派博氏金黄杆菌X191（Chryseobacterium piperiX191）、A122：皱纹假单胞菌A122（Pseudomonas corrugata）。碱性土壤，接种这5株高效铁载体菌株，均能促进番茄苗生长，但是不同菌株效应不同，尤其是Q191、B152、A122对番茄根长、苗鲜质量促进作用效果显著。这可能是因为不同菌株具有不同的促生功能。科赫氏芽孢杆菌作为功能菌株在植物病害防治及环境污染物降解生物材料的研发中广有报道[18,77](王学文，2023、Vadivel M，2023)，假单胞菌在铁载体分泌，缓解植物缺铁黄化，促进植物生长，报道较多[16](韦鑫，2024)。沙雷氏菌在植物促生、解毒、防病等相关研究多有报道[34,71](Caneschi W L，2019、Singh R P，2015)。液化沙雷氏菌铁载体与吲哚乙酸分泌等植物促生、生防特性及功能菌开发方面多有报道[34, 51,53](Caneschi W L，2019、Khan A R，2017、Li M，2019)。派博氏金黄杆菌作为促生、生防菌多有研究[43,72](Hahnke R L，2016、Strahan B L，2011)。绿针假单胞菌有关菌株研究具有高产铁载体的能力[ 36,56,73](Catara V，2007、Liu Y，2018、Strano C P，2017)，枯草芽孢杆菌常作为促生、防病菌在生产中广泛应用[1,60](戴美松，2021、Nalli Y，2022),在铁载体功能菌株相关研究中也多有报道[41,68](Ferreira C M H，2019、Sarwar S，2020)。本研究显示碱性土壤栽培的大樱桃根际筛选出的枯草芽孢杆菌Q191具有较高的铁载体分泌功能。
有研究认为铁载体活性单位(su)高于50%为高效铁载体菌株[19](王亚军，2022)，本研究中选用的5菌株铁载体产量均在63.57%~78.27%范围内，属于高效铁载体菌株。Sarwar et al在花生根际筛选筛选出3株铁载体菌株铁载体产量68%-73%，与本实验应用菌株的产量相似[68](Sarwar S，2020)。在碱性（钙质）土壤中生长的果树作物面临铁(Fe)缺乏引起黄化[30,61](Alexander D B，1993、Nazanin G，2017)，幼叶总铁元素含量为重要衡量指标之一[29,52](Ahmadi H，2023、Leece D R，1975)。碱性（钙质）土壤（pH 8.3-8.6, Ca 3276.131mg·kg-1）为栽培基质，以果树模式植物番茄为材料进行盆栽实验，接种5种高效铁载体菌株，除Q192均能显著提高了番茄幼叶铁元素含量，研究显示接种铁载体菌株提高了植物铁营养含量，促进植物生长，不同菌株接种不同植物效果不同 (Adam E，2016、Ahmadi H，2023、Alexander D B，1993、Ferreira C M H，2019、Sharma A，2003)。高产铁载体菌株接株接种能提高植物铁营养，本研究相关性分析（pearman correlation analysis）显示菌株铁载体分泌量与番茄幼叶铁元素含量没有相关性（R=0.90，p=0.081），尤其Q192 铁载体分泌量较高，而并没有显著提高番茄幼叶铁元素含量，所以高产铁载体菌株并不一定是高效铁载体菌株，铁载体分泌量高的菌株并不一定能作为某种作物的铁载体功能菌株用来提高其铁营养，缓解植物的缺铁黄化，这可能与菌株铁载体分泌类型有关，Delaporte-Quintana et al(2020) 探讨了铁载体菌株Gluconacetobacterdiazotrophicus PAL5 and Azospirillumbrasilense REC3 对草莓植株铁营养吸收的效应的影响，结果显示羟基酸型比儿茶酚型效果更好[38](Delaporte-Quintana P，2020)，而Abiraami et al (2021) 研究不同铁载体类型对缺铁情况下小麦及番茄铁营养吸收效应,显示儿茶酚型比羟酸和羧酸铁载体效果要好[27]。Buyer and Sikora (1990) 研究显示不同类型铁载体竞争性与稳定性不同，这强烈依赖根际pH环境,而大部分功能菌株具有复合功能，如铁载体菌株在分泌铁载体的同时能分泌有机酸类物质，降低植物根际pH,会更有利于提高根际环境植物有效铁的浓度，提高根系铁还原酶活性增加，促进铁元素的吸收[46](İpek M，2017)。Johnso et al (2002) 研究也显示不同类型铁载体形成的铁螯合物还原活性不同，提供铁能力不同[48](Johnson G V，2002)。不同类型的铁载体活性不同,高活性铁载体铁强化效应更好，Patel et al (2018) 研究显示Pantoea dispersa MPJ9 andPseudomonas putida MPJ6 分泌铁载体类型不同，但是 Siderophore activity 89.9% and 85.3% respectively, 结果显示对绿豆铁强化的效应高于其他菌株[63](Patel P，2018)。进来有研究认为 产生儿茶酚酸盐或羟酸盐铁载体类型的菌株具有潜在的开发应用价值，因为儿茶酚酸盐或羟酸盐铁载体这些化合物对铁具有最高的亲和力[41,44](Ferreira C M H，2019、Hider R C，2010)。因此最近有研究认为高效铁载体筛选需要考虑以下参数：efficiency ofiron-complexing capacity at pH 9.0, amount of siderophore produced, type ofsiderophore, speed of siderophore production, growth of the strain [33,41](Buyer J S，1990、Ferreira C M H，2019). <在碱性（钙质）土壤中生长的果树作物面临铁(Fe)缺乏引起黄化[41,46](Ferreira C M H，2019、İpek M，2017), 虽然叶绿素中不含铁，但铁对于叶绿素的合成和光合机构的运作是必需的[32](Broadley M，2012)。因此在碱胁迫下，植物往往表现出生长抑制和产量损失，同时叶绿素合成受阻，光合能力显著下降[81](Zhou C，2018)。碱性土壤接种铁载体菌株，可以提高绿豆叶片叶绿素含量及生物量[30,70](Alexander D B，1993、Sharma A，2003)，本研究也显示了相似的结论。在本研究中，在碱性（钙质）土壤条件下，与对照相比，接种铁载体菌株的番茄表现出更好的生长性能，总生物量和根系生物量均高于对照。接种植株的叶绿素水平和光合效率也显著高于对照，说明接种铁载体菌株减轻了碱胁迫对番茄的不利影响。不同菌株效应不同，尤其是Q191、B152、A122效果显著。叶绿素含量与净光合效率与生物量的积累呈相同的趋势，相关分析限制番茄总鲜重与叶绿素含量（R=0.83，p=0.041）及净光合效率（R=0.84，p=0.037）呈显著正相关。番茄幼叶总铁含量与叶绿素含量及净光合速率变化趋势相似，总铁含量高，叶绿素含量与净光合速率也会有一定的增加，线性相关分析显示总铁含量与叶绿素含量（R=0.75，p=0.087）并未呈现明显的相关性，而总铁含量与净光合速率（R=0.91，p=0.012）呈现明显的相关性。部分研究显示了相似的研究结果，随着植物叶片铁含量的增加，植物叶绿素含量及光合速率呈现相同的增长趋势[59](Molassiotis A，2006)。碱胁迫能够直接或间接地影响植物PSⅡ的功能，通过对快速叶绿素荧光诱导动力学曲线（OJIP）及JIP-test数据的分析，可深入探究环境条件的改变对植物PSⅡ的影响以及光合机构对环境变化的适应机制[24,77](周贝宁，2021、Vadivel M，2023)。本研究OJIP显示，碱性土壤导致番茄叶片O-J段荧光提高（CK），O ~ J段荧光值增加是由于PSⅡ受体侧电子传递受阻导致供体侧不断产生多余的能量以荧光形式释放形成的，Fo数值的增加也体现了相同的结论，而，Fv 下降反映了PSⅡ反应中心QA氧化态数量减少，使QA→QB传递电子的能力下降[39](Dias M C，2010)，接种铁载体菌株不同程度降低了O-J 荧光强度及Vj, Mo值的显著降低，表明接种处理促进了QA到QB的电子传递及PSⅡ反应中心活性[3,6](顾博文，2021、孔芬，2016)。接种铁载体菌株Q192 Vi 显著低于其他处理与对照，表明叶片电子经过质体醌B（QB）时的能量耗散比率显著降低[2](冯建灿，2002)，而其他接种处理差异不显著。碱性土壤导致番茄叶片Mk值明显高，说明放氧复合体（OEC）结构不完善或光合能力受损，阻碍了反应中心电子的传递，接种不同菌株，降低Mk点的荧光强度，说明接种功能菌株能完善放氧复合体（OEC）结构，促进了电子传递[9](李旭新，2013)。Fv/Fm，PIabs能反映胁迫对植物光合结构的影响，并评估植株受胁迫的程度以及植株对光能的利用率, 胁迫导致Fv/Fm，PIabs下降[14,77](欧阳芳群，2024、Vadivel M，2023), 本研究碱性土壤接种铁载体功能菌株能显著提高Fv/Fm和PIabs，缓解碱性胁迫对光合性能的抑制，促进反应中心活性及电子传递，改善光合利用率。碱性土壤接种铁载体菌株显著提高了ψo，φEo 及φRo，ψo提高，表明碱性土壤接种铁载体菌株促进番茄叶片PSⅡQA-到QB的电子转移过程,可能是光合色素类囊体的破坏引起的，从而提高了捕获的光能用于驱动QA-往下进行电子传递的概率（φEo）[4](郭葳，2024)，φRo 提高，表明碱性土壤接种铁载体菌株促进番茄叶片PSⅡ反应中心最大光化学效率[7](李明安，2020)。根据Strasser等的能量流动模型[74](Strasser R J，2000)，植物叶片吸收的总能量（ABS），一部分以荧光的形式释放，大部分被反应中心（RC）捕获（TR）,被反应中心捕获的能量中有一部分通过QA的还原氧化导致电子传递（ET）；另一部分以热耗散的形式释放出了（DI）。本试验得出番茄幼苗叶片PSⅡ中心活性影响较大，接种铁载体菌株后，ABS/RC˃TRo/RC˃ETo/RC˃DIo/RC, 而对照处理由于碱性胁迫的影响导致ABS/RC˃TRo/RC˃DIo/RC˃ETo/RC，热耗散显著高于处理。单位面积吸收的光能（ABS/CSm）、单位面积捕获的光能（TRo/CSm）、电子传递的量子产额（ETo/CSm）及单位面积吸收的光能（DIo/CSm）显示了相同的变化趋势，也验证了这一结论。综上所述，碱性土壤接种铁载体菌株促进了番茄幼苗叶片PSII 电子传递能力，主要表现为缓解了碱性胁迫导致的供体侧放氧复合体OEC 受到损伤，以及电子受体侧电子从QA向QB的传递受阻。同时，维持了因为碱胁迫打破的叶片光能吸收和分配的平衡，促进了电子传递能量的增加，降低了用于热耗散的能量。4.2 结论 综上所述，得出以下结论：(1)本研究通过铬天青平板法对164株大樱桃根际微生物的产铁载体能力进行定量检测，84株菌株发生显色反应，筛选出5株高效产铁载体菌株，明显出现颜色反应的菌株为Q191、Q191、B152、X191以及A122，铁载体相对分泌量为78.27%-63.57%，筛选出5株目的菌株，分别为Q191(枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis)、Q192（科赫氏泡状芽孢杆菌Cytobacillus kochii）、B152（液化沙雷氏菌Serratia liquefaciens）、X191(派博氏金黄杆菌Chryseobacterium piperi)和A122（皱纹假单胞菌Pseudomonas corrugata）；(2)这些菌株不仅具有分泌铁载体的能力，还表现出多种植物促生特性，包括分泌吲哚乙酸、溶解有机磷、无机磷以及固氮与解钾能力，其中IAA产量为3.41-20.94 mg/L，菌株A122、Q192、X191、Q191具有溶有机磷能力，菌株A122具有较强固氮能力，所有菌株溶无机磷与解钾能力均在1.50-2.50之间；(3)所有供试菌株均表现出促进番茄植株根系生长和地上部生物量增加的作用，其中菌株Q191、Q192、B152和A122对根系的生长及叶片鲜重的提升效果尤为突出；接种Q191、B152、X191和A122的番茄植株，其叶片铁含量明显高于对照组；经菌株处理的植株其最大光化学效率也显著增强。 综上，Q191、B152和A122菌株表现出优异的促生和铁活化能力，可作为潜在的功能微生物菌剂，用于开发防治大樱桃缺铁黄化的微生物肥料。本研究通过发掘具有铁载体功能的菌株，这些菌株不仅促进了番茄的整体生长，还显著提高了其对铁等营养元素的吸收和利用效率、叶片光合性能及荧光特性等，以调节大樱桃根际微生态环境，进而有效防治或缓解其叶片的缺铁黄化现象，从而显示出作为微生物肥料研发的理想候选菌株的潜力，为研究碱性（石灰质）土壤条件下大樱桃叶片的缺铁黄化问题更进一步。本研究为利用根际促生菌（PGPR）调控植物铁营养、提高石灰性土壤作物生产力提供了新的理论依据和技术支撑。为了进一步验证这些菌株在实际应用中的效果，我们计划在未来的研究中开展田间试验，以评估它们在更复杂自然环境下的表现。我们还将深入研究这些菌株的铁载体产生机制及其与植物根系相互作用的分子机理，以期为开发高效、环保的微生物肥料提供科学依据和技术支撑。此外，我们还将探索这些菌株与其他农业措施的协同作用，如与有机肥料的配合使用等，以期实现更优化的土壤改良和植物营养管理策略。
LADDEPB202500023311徐州工程学院 施雨希.pdf
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